В недавно опубликованной статье в журнале Virologica Sinica ученые описали разработку и валидацию мощного нанотела, которое нацелено на рецептор-связывающий домен (RBD) коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV).
Нанотело эффективно и специфично блокирует взаимодействие между RBD и ангиотензин-превращающим ферментом 2 (ACE2) и нейтрализует вирус.
Ученые использовали технологию фагового дисплея для создания библиотеки нанотел из мононуклеарных клеток периферической крови, выделенных из иммунизированных альпак. В общей сложности они провели четыре раунда биопэннинга с последующей идентификацией моноклональных фагов с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) и секвенирования. Наконец, они выбрали четыре положительных клона (S14, S15, S21 и S22) для очистки нанотел с помощью аффинной хроматографии.
Ученые провели ELISA, чтобы охарактеризовать выбранные нанотела. Результаты показали, что три из четырех нанотел эффективно связываются с SARS-CoV RBD. Основываясь на этих выводах, они выбрали нанотело S14 для дальнейшей характеристики.
Они выполнили биослойную интерферометрию и анализ нейтрализации псевдовируса, чтобы определить кинетику связывания и эффективность нейтрализации S14 против SARS-CoV, соответственно. Результаты показали, что S14 связывается с SARS-CoV RBD с высоким сродством и эффективно блокирует проникновение SARS-CoV в клетки-хозяева.
Напротив, S14 не проявлял никакой связывающей или нейтрализующей активности против псевдовируса SARS-CoV-2, что указывает на высокую специфичность S14 против SARS-CoV.
Ученые провели анализ конкурентного связывания и проточную цитометрию, чтобы определить, как нанотело S14 нейтрализует SARS-CoV. Результаты показали дозозависимое ингибирование взаимодействия SARS-CoV RBD с растворимым ACE2 нанотелом S14. Более того, ингибирование взаимодействия SARS-CoV RBD и экспрессируемого клетками ACE2 наблюдалось при высоких концентрациях нанотела S14. Однако эта ингибирующая активность S14 отменяется при низких концентрациях.
Согласно доступной литературе, остатки Y442, L472, N479, D480 и T487, присутствующие на интерфейсе SARS-CoV RBD — ACE2, играют жизненно важную роль в адаптации рецепторов хозяина, межвидовых инфекциях и эволюции SARS-CoV. Учитывая это наблюдение, ученые создали набор мутантов RBD, включая Y442A, L472A, N479A, D480A и T487A, чтобы определить, участвуют ли эти остатки в S14-опосредованной нейтрализации.
Результаты показали, что нанотело S14 эффективно связывается со всеми мутантами RBD, что указывает на то, что эти мутации не влияют на эффективность нейтрализации вируса S14.