Прогресс современных технологий в области молекулярной биологии обусловил совершенствование методов генетического анализа.
Сравнительно недавно возможности исследований с применением биологических методов в судебной медицине ограничивались определением ряда групповых маркеров эритроцитарных и сывороточных систем.
Экспертные возможности существенно расширились с внедрением анализа непосредственно материального носителя наследственности — дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Молекулярно-генетические методы прочно заняли одно из ведущих мест в судебно-медицинской экспертизе[11,12,29]. В некоторых странах созданы ДНК-банки, успешно используемые в судебной медицине и криминалистике [23, 31].
Обзор возможностей применения молекулярно-генетической диагностики в практике военной медицины представлен в отечественной литературе [9]. Однако применение методов, основанных на определении специфических последовательностей ДНК человека в судебной медицине, имеет ряд особенностей. Возможности исследования жидкой крови и выделений, волос и тканей человека, следов биологического происхождения с целью идентификации личности и установления родства методами молекулярного типирования намного специфичнее традиционных.
В процессе оплодотворения происходит объединение геномов (гаплоидного набора хромосом) яйцеклетки и сперматозоида, в результате чего образуется генотип нового организма. Гены, являющиеся функциональными единицами наследственности, могут существовать в одной из альтернативных форм, названных аллелями, которые, отличаясь последовательностью нуклеотидов, локализованы в локусах хромосом и могут передаваться по наследству. Все ядросодержащие соматические клетки человеческого организма содержат двойной набор генов (диплоидный набор хромосом) — уникальное сочетание парных аллелей генома. Генотип, в котором содержится программа развития каждого конкретного индивидуума, в течение всей жизни сохраняет постоянство, сама же генетическая информация кодируется последовательностью нуклеотидов.
Достигнутый прогресс в теоретических и практических разработках молекулярно-генетических методов на основе ДНК-анализа и дальнейшее их совершенствование являются основой для повышения судебно-медицинской экспертизы на качественно новый уровень. Современные способы консервации биологического ядросодержащего материала (криоконсервация крови и спермы, консервация клеток буквального эпителия фиксирующими жидкостями, консервация крови в виде пятен на специальных бумажных носителях и т. д.) создают базу для формирования банка биологического материала сравнения. Создание такого банка важно для лиц, выполнение профессиональных обязанностей которых связано с повышенным риском для жизни, в том числе для военнослужащих.
Например, распространенная сейчас криоконсервация делается без каких-либо последствий для донора. Как пояснили в известном центре «Нова Клиник» — необходимо лишь желание и время для сдачи анализов. Сам материал бережно отправляется в специальные пластмассовые хранилища, где замораживается до температуры -196 градусов по Цельсию. Смысл заморозки в том, что при такой температуре все биологичские процессы в сперме прекращаются. Таким образом, со временем, после разморозки, процессы возобновляются исперма сновая явялется «живой», т.е. способной оплодотворить яйцеклетку.
Перед криоконсервированием донор проходит необходимое обследование. Делается спермограмма, анализ на инфекции и вирусы, прочие исследования. Также производится анализ на сопсобность спермы пережить заморозку.
Следует отметить, что криоконсервирование открывает новые горизонты не только для отцов-доноров, но и для судебной медицины. Так, криоконсервированию могут быть подвержены генетические материалы жертв для дальнейшего поиска преступника в будущем.
В аспекте судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств, установления родства и идентификации личности полиморфизм ДНК можно условно разделить на две категории:
— полиморфизм уникальных последовательностей («кодирующих» участков ДНК, детерминирующих синтез .биологических продуктов, определяемых иммунологическими, биохимическими и другими методами). Он свойствен, например, генам комплекса HLA [10, 14, 15, 27, 28], рецептора липопротеина низкой плотности (LDLR), гликофорина A (GYPA), Су-глобина гемоглобина (HBGG) и группоспецифического компонента (GC) [14, 20];
— полиморфизм длины последовательностей («некодирующих» участков ДНК, информация о которых не может быть получена никакими другими способами кроме методов генетического анализа). Он свойствен мультиаллельным генетическим локусам, аллельные варианты которых содержат вариабельное количество тандемных повторов (variable number of tandem repeats — VNTR). Эти локусы можно разделить на две группы: собственно VNTR-локусы с длиной повтора от семи пар нуклеотидов (минисателлиты) [3, 13, 24, 27] и локусы, называемые короткими тандемными повторами, или локусы STR-muna (short tandem repeats — STR), с длиной повтора от двух пар нуклеотидов (микросателлиты) [17, 18]. Половую принадлежность объектов биологического происхождения определяют при анализе сегмента амелогенинового гена [4, 6], представленного в Х- и Y-хромосомах в виде участков с высокой степенью гомологии, цепь Х-хромосомы имеет в этом регионе вставку.
К генетическим маркерам предъявляются определенные требования: они должны обладать высокой полиморфностью и высоким уровнем гетерозиготности; их мишеневые последовательности должны легко и специфично амплифицироваться; методы детекции их аллельных различий не должны быть чрезмерно сложными. Кроме того, обязательное условие — наличие данных о частотах встречаемости интересующих аллелей, что позволяет математически обработать результаты ДНК-анализа, поскольку на основании этих данных производится расчет вероятности случайного совпадения выявленных признаков. Если ДНК-анализу подвергаются в комплексе несколько полиморфных маркеров, то следует обратить внимание на то, чтобы каждый из них наследовался независимо от других [26].
Открытие А. Джефрисом и соавт. (1985) особого семейства гипервариабельных участков ДНК — минисателлитной ДНК. — произвело революцию в судебно-медицинской экспертизе вещественных доказательств [22]. Первоначально методы анализа были основаны на исследовании полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ). Суть метода заключается в ферментативной рестрикции ДНК с помощью рестриктаз, «узнающих» различные последовательности нуклеотидов и разрезающих молекулу ДНК в местах, специфических для каждого вида рестриктазы. Полученные фрагменты разделяются методом гель-электрофореза в зависимости от длины фрагмента, а выявление полиморфных фрагментов из набора фрагментированной ДНК проводится с помощью гибридизационного анализа с использованием мультилокусных или локусоспецифичных зондов ДНК, маркированных радиоактивными или не радиоактивными метками. При использовании мультилокусных зондов на приложенной к мембране авторадиографической пленке образуется графический геномный отпечаток индивида в виде поперечных линий разной толщины, соответствующих числу и виду гипервариабельных фрагментов. Подобные линии, как и отпечатки пальцев, в своей совокупности индивидуальны, поэтому эта технология получила название «дактилоскопический отпечаток генома», или «ДНК-фингерпринт» [22]. Локусоспецифичные зонды идентифицируют последовательности, находящиеся в геноме лишь в единственном локусе. Эти зонды комплементарны к детектируемому тандемному повтору, что обеспечивает высокую специфичность исследований.
Применение ПДРФ-анализа в судебно-медицинской экспертизе имеет существенные ограничения. Во-первых, для его проведения требуется довольно большое количество относительно недеградированной ДНК (примерно 50 и 100 нг высокомолекулярной ДНК при использовании соответственно локусоспецифичных и мультилокусных зондов). Получить такие количества не всегда возможно. Для выделения указанного количества ДНК необходимо большое количество материала, при этом значительная часть образцов не может быть исследована повторно. Во-вторых, методами ПДРФ-анализа невозможно исследовать образцы биологического материала со значительной степенью деградации ДНК. В-третьих, широкое применение этого метода ограничивается технической сложностью и временем, затрачиваемым на его проведение (1-2 нед).
С учетом названных ограничений безусловно предпочтительным в производстве судебно-медицинских экспертиз (идентификация личности, решение спорного вопроса отцовства и материнства и т. д.) является использование полимеразной цепной реакции (ПЦР), представляющей энзиматический циклический процесс синтеза заданной нуклеотидной последовательности при участии термостабильной ДНК-полимеразы (например, Taq-полимеразы, получаемой из Thermus aquaticus), что обеспечивает накопление (амплификацию) этой последовательности ДНК в экспоненциальной зависимости. Эффективное «размножение» специфического участка ДНК-мишени, высокая чувствительность, специфичность и относительная быстрота исследования делают применение данного метода чрезвычайно удобным для решения задач судебно- медицинской экспертизы [2, 7, 10, 11, 13, 28]. В тоже время высокая чувствительность ПЦР-анализа вызывает ряд проблем: следует помнить о возможном загрязнении (контаминации) образцов чужеродной ДНК, недостаточности амплификации за счет присутствия в реакционной смеси тех или иных веществ- ингибиторов. Контаминация возможна за счет загрязнения вещественных доказательств или подготовленной пробы чужеродной ДНК из внешней среды, взаимного загрязнения между образцами в процессе выделения ДНК или проведения ПЦР, загрязнения образца ДНК, амплифицированной в ходе предыдущих исследований. Для обеспечения минимального риска необходима особая организация работы лаборатории, проводящей исследования с применением ПЦР. В ней должны быть, по крайней мере, три зоны [26].
Эти зоны необходимо с определенной периодичностью обрабатывать дезинфицирующими средствами и ультрафиолетовыми лучами во избежание загрязнения исследуемых проб чужеродной ДНК.
Особое внимание следует уделять выделению ДНК из субстрата. В настоящее время разработаны различные способы ее экстракции практически из любого ДНК-содержащего материала (крови и ее следов, волос, костной ткани, слюны, зубов и т. д.) [2, 7, 11, 26, 30]. Успешно применяется способ «дифференциального лизиса» для извлечения и последующего исследования генетического материала спермы и/или эпителиальных клеток из смешанных следов спермы и вагинального секрета [1, 8].
Амплификация и анализ ее продуктов (проведение ПЦР и всех манипуляций с амплифицированной ДНК: электрофорез продуктов ПЦР, гибридизация, хранение амплифицированной ДНК)
Помимо классического варианта возможно применение так называемой гнездовой ПЦР (nested PCR), повышающей чувствительность метода в сотни раз. Обычно такая разновидность метода используется для обнаружения латентной вирусной инфекции, когда количество искомой ДНК весьма незначительно. Первоначально реакция проводится с праймерами, соответствующими двум высококонсервативным областям генов, а затем с праймерами для мишеневой ДНК. Широкое распространение получила многомишеневая, или мультилокусная ПЦР, в которой подобранные пары праймеров позволяют проводить детекцию результатов одновременно нескольких ДНК-мишеней одного образца [14, 19]. В качестве альтернативы проведения гибридизации после проведения ПЦР возможно сочетание метода олигонуклеотидного лигирования и иммуно-ферментного анализа [16, 25].
В практике ПЦР-анализа, применяемого в судебно-медицинской экспертизе вещественных доказательств, при спорности происхождения детей, проведении идентификации личности, чрезвычайно важна интерпретация результатов исследования. Идентификационное значение тех или иных выявленных признаков определяется на базе вероятностных расчетов, основой для которых служат частоты встречаемости этих признаков в популяции, предварительно устанавливаемые опытным путем [5, 13, 14, 18, 21]. Данные о частотах встречаемости аллелей позволяют рассчитать вероятности случайного совпадения идентификационных признаков, что существенно повышает значимость экспертных исследований.
Методы молекулярно-генетического типирования объектов биологического происхождения (преимущественно с применением ПЦР) благодаря своей высокой информативности заняли лидирующее положение в экспертной практике. Вместе с тем применение этих методов связано с целым рядом организационных проблем, например практически с отсутствием каких-либо законодательных актов, регулирующих производство этого вида экспертных исследований. Не разработаны правила производства судебно-медицинских молекулярно-генетических экспертиз, хотя для прочих видов судебно-медицинских экспертных исследований такие правила устанавливаются приказом Минздрава РФ.
Для разработки регламентирующих актов в этой области наиболее рациональным было бы создание межведомственной комиссии из специалистов Министерства здравоохранения, Министерства внутренних дел и Министерства обороны. Требуют решения вопросы лицензирования лабораторий и сертификации специалистов.
Применение методов молекулярно-генетического типирования биологических объектов сопряжено с рядом других проблем, в частности материально-технического оснащения судебно- медицинских лабораторий МО РФ и их соответствия специальным санитарным нормам, обучения военных специалистов методам молекулярно-генетической идентификации. Необходимо снижение чрезмерно высокой себестоимости таких экспертиз, сдерживающей их широкое внедрение, создание оптимального алгоритма исследований подобного рода в случаях идентификации неопознанных тел, особенно при их массовом поступлении.
ЛИТЕРАТУРА
1.. Гыскэ Л.И., Иванов П.Л. // Суд.-мед. эксперт. — 1996. — Т. 39, N 1. — С. 16-21.
2. Заяц М.В., Иванов П.Л. // Суд.-мед. эксперт. — 1997. — Т. 40, N 1. — С. 17-24.
3. Котлярова С.Э. и др. // Су д.-мед. эксперт. — 1994. — Т. 37, N 3. — С. 19-21.
4. Овчинников И.В. и др. // Суд.-мед. эксперт. — 1993. — Т. 36, N 1. — С. 30-31.
5. Перепечина И.О., Гришечкин С.А. Вероятностные расчеты в ДНК- дактилоскопии:
Метод, рекомендации. — М.: Изд. ЭКЦ МВД России, 1996. — 16 с.
6. Перепечина И.О., Стегнова Т.Е. Установление половой принадлежности крови полимеразной цепной реакцией: Метод, рекомендации. — М.: Изд. ЭКЦ МВД России, 1995. — 16 с.
7. Пучков Г.Ф. и др. // Суд.-мед. эксперт. — 1997. — Т. 40, N 1. — С. 21- 23.
8. Стегнова Т.Е., Перепечина И.О., Пименов М.Г., Сыроквашева Е.Ю. Исследование следов спермы методом генотипоскопии: Метод. рекомендации. — М.: Изд. ЭКЦ МВД России, 1993. — 24 с.
9. Шевченко Ю.Л. и др. // Воен.-мед. журн. — 1998. — Т. 319, N 4. — С. 25-34.
10. Alien М., Saldeen Т., Gyllensten U. // BioTechniques. — 1995. — Vol. 19, N 3. -p. 454-463.
11. Brettell Т., Saferstein R. // Analyt. Chem. — 1997. — Vol. 69, N 12. — P. 123R-143R.
12. Biidowie В., Baechtel S., Comev C. et al. // Electrophoresis. — 1995. — Vol. 16, N 9. — P. 1559-1567.
13. Biidowie В., Baechtel S., Smenc J. et al. // J. Forensic. Sci. — 1995. — Vol. 40, N 1. — P. 38-44.
14. Biidowie В., Lindsey J., DeCou J. et al. // J. Forensic. Sci. — 1995. — Vol. 40, N 1. — P. 45-54.
15. Buyse I., Decorte R., Cuppens H. et al. // Tiss. Antigens. — 1993. — Vol. 41, N 1. -P. 1-14.
16. Delahunty С., Ankener У., Deng Q. et al. // Amer. J. hum. Genet. — 1996. — Vol. 58, N 5. — P. 1239-1246.
17. Edvards A. et al. // Amer. J. hum. Genet. — 1991. — Vol. 49, N 4. — P. 746-756.
18. Evett I. et al. // Amer. J. hum. Genet. — 1996. — Vol. 58, N 2. — P. 398- 407.
19. Fodor P., Rava R., Huang X. // Nature. — 1993. — Vol. 364, N 6437. — P. 555-556.
20. Herrin G., Fildes N.. Reynold R. // J. Forensic. Sci. — 1994. — Vol. 39, N 5. -P. 1247-1253.
21. Green P. // Amer. J. hum. Genet. -1992. — Vol. 50, N 2. — P. 440-441.
22. Jeffreys A., Hi/son V., Thein S. // Nature. — 1985. — Vol. 316, N 4. — P. 76-79.
23. McEwen J. // Amer. . hum. Genet. — 1995. — Vol. 56, N 6. — P. 1487- 1492.
24. Nakamura Y. // Science. — 1987. -Vol. 235, N 13. — P. 1616-1622.
25. Nickerson D. et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1990. — Vol. 87, N 22. -P. 8923-8927.
26. Reynolds R., Sensabaugh G., Blake E. // Analyt. Chem. — 1991. — Vol. 63, N 1. -P. 2-15.
27. Sajanila A. et al. // J. Forensic. Int. — 1991. — Vol. 51, N 1. — P. 23-34.
28. Saiki R. et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1989. — Vol. 86. — P. 6230-6234.
29. Schiver М. et al. // Amer. J. hum. Genet. — 1997. — Vol. 60, N 4. — P. 957-964
30. Walsh P., Metzger D., Higuchi R. // BioTechniques. — 1991. — Vol. 10, N 4. -P. 506-513.
31. Veedn V.W. // Atlanta Medicine. -1993. — N 3. — P. 55-57.